Сергей Владимирович, расскажите о фронте работ отдела геномных и постгеномных технологий, появившемся в Никитском ботаническом саду в Ялте.
В 2014 году Никитский ботанический сад выиграл структурный грант Российского научного фонда, и половина его была направлена на создание современного биотехнологического комплекса, одним из основных объектов исследований которого стал виноград. В ботсаду развернут комплекс лабораторий, в котором при содействии Курчатовского геномного центра, ВНИИСБ, ИБХ, института «Магарач» и других научных центров ведутся исследования винограда и прочих культур.
При слове «биотехнологии» зачастую сразу представляются пугающие ГМО, но вообще-то речь не только о них. Например, мы создаем отдел по производству безвирусного оздоровленного посадочного материала в условиях in vitro. Проектная мощность – порядка 1 млн саженцев. Первая в России партия оздоровленных подвоев Кобер 5ББ, свободных от вирусов и патогенов, уже используется, в частности, в институте «Магарач» для закладки маточников. Еще у нас есть контракт на подвои Гизела для вишни и даже на розы для эфиромасличного производства.
Сергей Владимирович Долгов. Фото: © из личного архива
Мы сейчас также размножили in vitro (в пробирке) 37 уникальных сортов из коллекции института «Магарач», теперь с этим материалом могут работать как селекционеры, так и питомники. Кстати, одно винодельческое хозяйство из Крыма заказало у нас материал для восстановления и создания маточника своего автохтонного сорта, сохранившегося в единичных экземплярах.
Что касается генной инженерии, то для виноградной лозы ее методы в мире отработаны достаточно слабо и в основном для нескольких модельных сортов. Мы выбрали подарок магарача – сорт отечественной селекции – для изучения возможностей повышения морозостойкости винограда путем генетической инженерии.
Для такой модификации в первую очередь нужно получить полноценный организм из одной донорской соматической клетки, «срегенерировать» ее. Мы попробовали сделать это двумя путями. Первый – из тканей листьев через образование каллюса на твердых средах: эффективность получилась порядка 50%, что для винограда – очень сложной и капризной культуры – весьма неплохо. Второй – соматический эмбриогенез в жидкой суспензионной культуре. Он дает возможность быстрого размножения какого-то ценного гибрида или модифицированной формы: в большом ферментере можно получать тысячи эмбриоидов. Да и эффективность была повыше.
Далее начинается собственно модификация. Есть огромное количество вариантов, как внести нужный нам ген в эмбриоид; это можно сделать на разных этапах его развития. Мы это все достаточно подробно изучили и в рамках уже более прикладного проекта смогли модифицировать виноград на устойчивость к холоду, вставив в него ген морозоустойчивости, причем в двух вариантах: как растительного происхождения, так и бактериального. Этот ген кодирует белок так называемого холодового шока (cold shock protein).
Эффективность модификации была порядка 0,5%, но мы вывели несколько трансгенных линий, получили целые растения и провели промораживание черенков: зеленые, почти готовые распуститься почки модифицированных растений сохранили жизнеспособность даже при -10 °C, при том что почки контрольных растений были поражены почти на 100%. Таким образом, мы получили полностью рабочий способ продвижения виноградарства на север – в зоны, к примеру, свободные от филлоксеры. Сейчас мы отрабатываем метод и для более известных коммерческих сортов.
Фото: © Архив SWN
Чем это лучше обычной селекции? Какие вообще есть методы селекции?
Начиналось все со случайного свободного опыления растений и отбора потомства с интересующими человека свойствами: крупные сочные плоды, высокая урожайность. Затем начали контролируемо скрещивать подобранные организмы и опять-таки отбирать потомство. Потом стали заниматься «отдаленной гибридизацией»: пытаться скрестить виды, которые в природе не скрещиваются по разным причинам. В ХХ веке с развитием техники появился мутагенез, радиационный или химический, внесение изменений мутациями. Следующий этап – линейная селекция, при которой используются гетерозисные гибриды первого поколения от скрещивания специально выведенных родительских пар. Но все эти методы носят случайный характер, их результаты не бывают однородны, всегда существует спонтанное перераспределение признаков у потомства, получается множество всевозможных вариантов, которые требуют десятилетий отбора, и иногда несколько поколений селекционеров занимается получением одного сорта.
Кроме того, во всех этих методиках реализуется ограниченный набор генов: по некоторым культурам, в частности по кукурузе, к середине ХХ века пул свободно переносящихся генов уже был фактически исчерпан – традиционная селекция почти достигла потолка своих возможностей.
Генная инженерия же в 1980-е годы показала, что мы можем внести отдельно ген определенного признака без нарушения сложившегося комплекса хозяйственно ценных признаков сорта. Вот, допустим, есть сорт – он устраивает производителей, урожайный, но поражается патогеном, и нам нужно сделать его устойчивым. Если мы будем делать это классическим методом через опыление, все качества нашего изначального сорта и донора устойчивости будут распределяться случайно, и нам нужно будет из тысяч, десятков тысяч потомков выбирать того единственного, кому повезло унаследовать и сортовые свойства, и устойчивость. Генно-инженерный же метод позволяет нам пропустить этот этап отбора и практически сразу получить растение с заданными свойствами, перенеся в наш сорт нужные нам гены. Так еще и донором признака может быть что угодно: и животное, и бактерия, и другие растения.
Фото: © Архив SWN
Звучит хорошо, но ведь коммерциализация ГМО запрещена не только в нашей стране, но и почти везде в Европе. Почему считается, что ГМО – плохо?
Есть целый комплекс причин. Любое кардинальное новшество вызывает в обществе определенное отторжение, особенно в таком, так скажем, традиционном, как наше. В более прагматичных странах – США, Канаде, Австралии – это все воспринимается гораздо проще. В России, когда построили первую железную дорогу из Царского Села в Петербург, по ней никто не хотел ехать: дескать, бесовское дело. И пока Николай l с семьей там не проехал, ситуация не менялась. Другой пример: в 1896 году в Лондоне впервые в ДТП погиб человек – после этого парламент заседал на предмет полного запрета автомобилей. И так происходит с любым новшеством. Сильно влияет психология. Возьмем, например, лекарства. Там до 30% чисто биоинженерных веществ. Тот же инсулин. Но это всегда воспринималось так, что, если ты уж заболел, что-то чужеродное принесет больше пользы, чем вреда. А еда – это вроде бы как наша основа. «Ты то, что ты ешь» – к продуктам питания особенное отношение.
Но, наверное, самый главный фактор – экономика. Например, в Испании, в каком-нибудь Коста-дель-Соль, практически все побережье покрыто теплицами, где выращивают томаты. И вот представьте: если поступит на рынок дешевый американский трансгенный томат – это же все разорится. Европа в этом вопросе в первую очередь защищает свой рынок. В странах с достаточно высоким уровнем жизни в XXI веке население выдвигает повышенные требования к «экологии». Плюс движение зеленых. Пусть вот у них там, в Юго-Восточной Азии, в Африке, люди производят ГМО-продукт за копье, а мы будем считать, сколько коровы выделяют метана в атмосферу.
Резюмируя – политика, экономика, менталитет. Для американцев прагматизм диктует: все, что приносит деньги, – хорошо, и мы это делаем. В мире уже под 200 млн гектаров занято ГМ-культурами: соя, кукуруза, хлопок, которые уже не трансгенные найти можно только в каких-то фермерских хозяйствах.
Прошлой осенью я был в Узбекистане – там на полях хлопок уже трансгенный. Причем не американский: они сами сделали свой ГМ-хлопок. Вся соя и кукуруза в Латинской Америке трансгенная, а в Аргентине уже и пшеницу выращивают модифицированную.
Фото: © Polina Rytova / Unsplash
А по плодовым культурам, если уж не винограду, то яблочкам: есть ли в мире какие-нибудь генетически модифицированные формы, которые уже имеют практическое применение?
Практически у любой культуры есть, скажем так, критический признак, который интересует производителей. Например, у косточковых культур это устойчивость к вирусу шарки. Шарка – бич во всем мире. В свое время я сотрудничал с американским ученым Ральфом Скорцей, и мы параллельно смогли получить формы сливы, устойчивые к шарке: у него результат через гипокотиль, а у нас через лист. То, что создал Скорца, в Америке возделывается уже чуть ли не с 2010 года.
Мы получили нашу форму позже, но более современным способом – у нас даже технология вышла поэффективнее – но она у нас, увы, растет лишь на опытном участке. Таким же образом сравнительно недавно спасли мировую культуру папайи.
В 1990-е годы на Гавайях появился вирус кольцевых пятен, который уничтожил всю папайю и начал быстро распространяться по миру. И вот папайя стала первым в мире трансгенным плодовым растением с иммунностью к этому вирусу. С 1990-х годов ее выращивают на Гавайях, сейчас уже и на Филиппинах, и именно благодаря этой трансгенной форме с вирусом удалось справиться.
Дальше по плодовым. В яблоке содержится комплекс окислительных ферментов, работу которых отлично видно невооруженным глазом: срез яблока и выдавленный сок быстро буреют. В Канаде недавно создали и разрешили к использованию форму яблони, в которой подавили ген, ответственный за синтез этого фермента, и теперь осветлять сок существенно дешевле.
Фото: © Anna Kaminova / Unsplash
Винограду пока похвастаться такими результатами не удастся. Судя по беседам с виноделами, которым я всегда задаю этот вопрос, для винограда одной из ключевых проблем остается филлоксера, так как привитые саженцы все же уступают по качеству плодов корнесобственным. У нас прямо сейчас подана заявка на грант в этом направлении, и мы уверены: проблему филлоксеры можно решить биоинженерным путем.
Помимо винограда и плодовых, значительным достижением я считаю одну совместную работу нескольких лабораторий нашего Института биоорганической химии, недавно опубликованную в журнале Nature Biotechnology: светящиеся растения. Одна лаборатория занималась расшифровкой генов, ответственных за биолюминесценцию (свечение) грибов на основе люциферина и люциферазы, а в нашей лаборатории мы модифицировали растение. Мы смогли – впервые в истории живой природы – получить светящееся растение. Ну, оно, естественно, не светит, как настольная лампа, видно это будет только в полной темноте – но оно светится! Растение само синтезирует субстрат люциферин, само синтезирует фермент люциферазу – и просто светит. Мы перенесли целый кусок, пять генов.
В Америке мои коллеги организовали стартап Light Bio, принимают предзаказы на модифицированные светящиеся петуньи (стоят они совсем недорого). А в контексте научного достижения и создания «идеального растения» это такой рывок в сторону синтетической биологии. Мы смогли в растение внести не один ген, не один белок, а целый метаболический цикл, которого нет не только в петуниях – его нет вообще в растениях.
Можно ли предположить, как та или иная модификация устойчивости может повлиять на качество урожая?
Только экспериментально проверить. Если мы меняем какой-нибудь транскрипционный фактор, он тянет за собой целый шлейф изменений в экспрессии генов, и мы не знаем, на какое количество генов такая модификация окажет влияние. Конкретный вот этот ген морозостойкости меняет очень мало – это только один колд-шок-белок, который, по идее, не должен оказывать влияния на остальную биохимию растения.
Хотя есть обратные прецеденты. Например, на томате была проведена работа по выключению синтеза этилена (гормона созревания) с помощью РНК-интерференции. Получилось, зрелый плод томата лежит на столе 120-140 дней, с ним ничего не происходит, хранится великолепно – только вот он безвкусный абсолютно.
Можно ли создать «идеальную» форму винограда? Чтобы она была устойчива и ко всем болезням, и к холоду-засухе, и с великолепным качеством урожая?
На нашем этапе развития биоинженерии вряд ли. Некоторые параметры взаимоисключающие, их нельзя скомбинировать в принципе. Многие гены несут обратные свойства.
Фото: © Архив SWN
Сейчас мы активно исследуем геномику винограда. В рамках Курчатовского геномного центра выполняется множество работ, изучаются детали экспрессии различных генов и в целом принципы работы признаков растений.
Например, если у сорта высокая засухоустойчивость, то будет низкая морозоустойчивость, и наоборот. К сожалению, множество интересных свойств – устойчивость к грибным заболеваниям, к различным стрессам и условиям внешней среды – настолько мультигенные и сложные, что пока существующими технологиями работать с ними возможным не представляется. Практически сейчас возможна работа с моногенными, ну хотя бы двух-трехгенными признаками, как вышеупомянутая морозостойкость, через колд-шок-белок. Светящиеся растения – пока самое сложное, что нам удалось: тогда была внесена структура из пяти генов.
Вы приводите показатели эффективности вашей работы с подарком магарача: около половины клеток регенерируют, модификация вообще дается с трудом, и тем не менее это вполне применимые технологии. Почему все так сложно для винограда?
Как правило, чем более специализирована и ценна культура, тем тяжелее она поддается биотехнологическим методам. Теоретически есть такое понятие – тотипотентность, постулирующее тезис о том, что любая растительная клетка, «вырванная» из организма, способна, как стволовая клетка у животных, путем деления регенерировать обратно в целый организм. На практике эта теория, естественно, подтверждается, но какие-то виды регенерируют более-менее легко (преимущественно малоценные для хозяйства), а у каких-то видов это получается очень тяжело. С чем это может быть связано, пока не ясно.
Фото: © Архив SWN
Сейчас на слуху уже такие вещи, как цис- и интрагенные растения. Как бы не ГМО, но тоже вроде бы плохо. В чем разница?
Ответ на вопрос, что такое ГМО, зависит от трактовки. В широком смысле ГМО – это организм, в который искусственно внесены изменения. Сюда попадает ну вообще все: и отдаленное скрещивание (традиционное, между прочим, та же изабелла), и мутагенез, и геномное редактирование.
Если же узко, ГМО – это когда мы в организм привнесли чужеродный ген. Тут возникает множество промежуточных вещей, например, цисгенные растения – это когда мы взяли ген именно растения и привнесли в другое растение. Интрагенез – мы вообще не привносим ничего нового, а только изменяем существующий организм, редактируем его: изменяем промоторы, регуляцию, меняем местами гены. В целом считается, что это более природоподобные технологии, но возьмем цисгенез – чем это отличается от классической, всеми признанной отдаленной гибридизации? С научной точки зрения объяснить невозможно.
С точки зрения технологии редактировать очень сложно. Для модельных культур арабидопсиса или табака – еще более или менее, а культурные растения – достаточно сложно и затратно. Мы недавно мультицистронно отредактировали геном тритикале (пшенично-ржаной гибрид) – невероятно трудоемкий процесс, требующий как высокой квалификации исполнителей, так и значительных затрат на аналитику и эксплуатацию фитотрона. Очень сложно, извините.
Материал впервые был опубликован в Simple Wine News №166.
Фото на обложке: © Андрей Ковалев.